Innovative, leistungsstarke und präzise Testsysteme für die Abwasseranalytik
Für unsere mikrobiologischen Analysen des Abwassers verwenden wir die quantitative Real-Time PCR-Methode, abgekürzt qPCR.
Die qPCR-Technologie wird heute überall dort eingesetzt wo es wichtig ist schnell, hochspezifische, aussagekräftige und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Bedingt durch diese Vorteile hat sich die qPCR-Technologie als eine der tragenden Säulen in der Lebensmittelanalytik, der veterinär- bzw. medizinischen Diagnostik bereits erfolgreich etabliert.
Die Leistungsfähigkeit dieser Testssysteme zeigt sich in der Tatsache, dass die qPCR weltweit während der Coronavirus-Pandemie als die Methode der Wahl zur Testung auf SARS CoV-2 in der medizinischen Diagnostik und neuerdings zur Bestimmung des Coronavirus im Abwasser eingesetzt wird.
Für unsere Analysen setzen wir Duplex qPCR-Testsysteme ein, mit denen sowohl die Gesamt- als auch die Lebendzellzahl von Mikroorganismen gleichzeitig quantifiziert werden. Diese Tests besitzen somit jene Eigenschaften, die notwendig sind um Brauch- und Abwasserproben hochspezifisch, präzise und zuverlässig zu analysieren.
Die Durchführung von Real-Time PCR Analysen erfolgt in zwei Schritten:
Schritt 1: DNA-Extraktion direkt aus der Abwasserprobe
Hierbei werden als erstes alle Zellwände der enthaltenden Mikroorganismen aufgebrochen damit die DNA-Moleküle frei vorliegen. Die DNA-Aufreinigung erfolgt mittels spezieller DNA -Extraktionssäulen. Auf diese Extraktionssäulen wird die Lösung bestehend aus freier DNA und den aufgebrochenenen Zellfragmenten gegeben. Die Zellfragmente können die Säule durchfließen und werden abgetrennt. Die DNA hingegen wird an der Säulenmatrix gebunden und zurück gehalten. Im letzten Schritt wird die DNA von der Säule mittels speziellem Puffer eluiert. Die extrahierte, hochreine DNA spiegelt die ursprüngliche mikrobiologische Situation in der Probe direkt und realitätsgetreu wider und ist das Ausgangsmaterial für die anschließende qPCR Analyse.
Schritt 2: qPCR-Analyse
Zur extrahierten Proben-DNA wird ein qPCR-Mix gegeben, der alle nötigen Reagenzien und bakterienspezifischen Fluoreszenzgensonden für die Detektion der Zielbakterien beinhaltet. Dieser Testansatz wird in ein PCR-Reaktionsgefäß pipettiert und in das qPCR-Gerät (qPCR-Cycler) gegeben. Durch zyklisches Erhöhen bzw. Absenken der Temperatur im Reaktionsgefäß werden die Ziel-DNA-Moleküle enzymatisch vervielfältigt. Für jedes einzelne neu vervielfältigte DNA Molekül wird je genau neues ein Fluoreszenzgensondenmolekül freigesetzt. Somit steht die Menge des freigesetzten Fluoreszenzfarbstoffs in direktem Zusammenhang mit der Menge an neu synthetisierter DNA.
Am Ende der qPCR-Analyse berechnet ein Computerprogramm anhand der entstandenen Fluoreszenzintensität im Reaktiosgefäß die Menge an DNA in der ursprünglichen Probe. Durch die computergestützte Datenauswertung entfällt eine Fehleranfälligkeit und Messungenauigkeit bedingt durch menschliche Ergebnisinterpretation. Die qPCR-Analysendauer für 96 Proben beträgt circa. 40 – 45 Minuten.
Das Basis- und Flex-System – Analysen maßgeschneidert an Ihre Anforderungen
Das Volumen der extrahierten DNA ist ausreichend für die gleichzeitige Bestimmung von bis zu 8 Bakterientypen aus einer Probe. Da der Schritt der DNA-Isolation nur einmal pro Probe anfällt, können zusätzliche qPCR-Bestimmung aus der gleichen Probe vorgenommen und deshalb kostengünstiger angeboten werden.
Basis-Analysen: Diese Analysen beinhalten die Durchführung der DNA-Isolation und die Durchführung der entsprechenden qPCR-Analyse.
Flex-Analysen: Hier wird die bereits isolierte DNA aus einer Basisanalyse genutzt um weitere, zusätzliche qPCR-Bestimmungen durchzuführen. Die zusätzlichen Analysen sind frei wählbar. Flex-Analysen können nur in Kombination mit Basis-Analysen durchgeführt werden.
Ihre Vorteile von Basis- und Flex-Analysen
- Die DNA-Extraktion wird nur einmal berechnet, es entstehen keine unnötigen Kosten
- Dienstleistungen ideal angepasst an Ihre Anforderungen
- Multiparameter-Bestimmungen aus ein und derselben Probe
- Bis zu 8 Bestimmungen gleichzeitig aus einer Probe
- Flex-Analysen können auf jeden Probentyp angewendet werden
- Unterschiedliche qPCR-Bestimmungen sind nach Bedarf frei kombinierbar
- Kostenreduktion durch maßgeschneiderte Analysendientleistungen
Häufig gestellte Fragen:
Mit unseren Tests können eine Vielzahl von Wasserproben (Zulauf, Belebungsbecken, Ablauf, Prozesswasser und Faulturm einer Kläranlage, Flusswasser, Brunnenwasser und Brauchwasser) untersucht werden.
Die Handhabung hierfür ist denkbar einfach. Die DyeNA Genetics schickt Ihnen die Probenröhrchen und bereits frankierte Briefumschläge zu. Die Probe wird in das Röhrchen gefüllt, in den Briefumschlag gegeben und mit der Post verschickt.
In der Regel trifft die Probe mit der Post am nächsten Tag in unserem Labor ein. Das Analysenergebnis wird normalerweise binnen 48 Stunden nach Probeneingang elektronisch zugestellt.
Die Abkürzung VBNC steht für „viable but non-culturable“ aus dem englischen und bedeutet „lebensfähige, aber nicht kultivierbare“ Bakterien.
Nach heutigem Wissenstand ist nur ein kleiner Anteil an Bakterien aus Umweltproben kultivierbar. Der größte Anteil kann mit mit künstlichen Nährmedien nicht nachgewiesen werden. Hierzu kommt noch die Gruppe an grundsätzlich nicht-kultivierbaren Bakterien.
Mittels qPCR-Technologie werden die Bakterien direkt, ohne Kultivierung, in der Probe detektiert und geben ein umfassendes und direktes Bild der vorkommenden Bakterienarten in der Probe wieder.
Mit der qPCR-Technologie wird die Gen-Menge in einer Probe bestimmt. Ob diese Gene von lebenden oder toten Zellen stammen kann normalerweise nicht unterschieden werden. qPCR-Messwerte geben somit eigentlich nur die Gesamtzellzahl an.
Durch die Kombination von Real-Time PCR mit weiteren innovativen Technologien, die in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden, sind die Testsysteme der DyeNA Genetics in der Lage ebenfalls Gene von lebenden Bakterienzellen zu bestimmen.
Diese Eigenschaft macht unsere Testsysteme einzigartig und optinal geeignet für den Bereich Abwasseranalytik. Weiterhin sind wir auch das erste Unternehmen, mit dessen Tests es möglich ist die bakterielle Lebendzellzahlen in Abwasserproben präzise zu bestimmen.
In der medizinischen Diagnostik werden fast ausschließlich Duplex-Testsysteme eingesetzt. Hierbei werden das bakterielle Zielgen und eine sogenannte „interne Kontrolle“ (abgekürzt IC) gleichzeitig nachgewiesen (s. Abb. rechts).
Die IC ist ein meist künstliches DNA- oder RNA-Genfragment, das als Prozesskontrolle zu der Abwasserprobe gegeben wird. Die IC durchläuft den gesamten Aufreinigungsprozess und wird am Ende mit der Proben-DNA bzw. Proben-RNA von der Extraktionssäule eluiert.
Bei der qPCR-Analyse wird die IC quantifiziert und dieser Wert muss in einem vorgegebenen Bereich liegen.
Hierdurch wird gewährleistet, dass mögliche Fehlerquellen wie Inhibition der Enzymreaktion oder eventuelle Störungen der RNA/DNA-Extraktion sofort angezeigt und erkannt werden.
Die Verwendung eines Duplex qPCR-Konzepts macht unsere Testsysteme zuverlässig, sichert unsere Messergebnisse ab und verleiht unseren Ergebnissen eine hohe Analysenqualität.
Bei Multiplex-Tests werden mehrere Bakterienarten in einer qPCR-Analyse gleichzeitig in der gleichen Probe nachgewiesen. Zum Beispiel bei unserer qPCR-Bestimmung der Nitrifikanten werden die Amonium- bzw. die Nitrit-oxidierenden Bakterien und Nitrotoga aus der gleichen DNA-Probe bestimmt.
Die gleichzeitige Analyse liefert sehr zuverlässige Ergebnisse da mögliche Schwankungen innerhalb des Probenmaterials augeschlossen werden. Alle unsere Multiplextest sind ebenfalls durch eine interne Kontrolle (s. Duplex-Tests) abgesichert, die unseren Messergebnissen eine hohe Analysenqualität verleiht.
Alle isolierten DNA-Proben werden bei uns für einen Zeitraum von 24 Monate bei -20°C gelagert.
Die DNA-Proben sind bei dieser Temperatur über Jahre stabil und können zu einem späteren Zeitpunkt erneut für eine qPCR-Analyse verwendet werden.
Sollte eine später auftretende Fragestellung weitere qPCR-Bestimmungen von vorangegangenen Proben erfordern so ist dies problemlos möglich. Mit unseren Dienstleistungen können die mikrobiologische Situation in der Gegenwart und auch nachträglich in der Vergangenheit zuverlässig zu bestimmen.
Die Vorteile einer Gefrierkonservierung von DNA-Proben
- Kostenfreie Lagerung der DNA-Proben bei -20°C für 24 Monate durch die DyeNA Genetics
- Dienstleistungen auch nachträglich maßgeschneidert an Ihre Anforderungen
- Weitere qPCR-Bestimmungen aus eingefrorenen Proben sind problemlos möglich
- Zusätzliche Analysen sind kostenreduziert, da die DNA-Isolation bereits erfolgte
- Jede DNA-Probe aus Zulauf, Belebungsbecken, Ablauf, Prozesswasser und Faulturm kann aufbewahrt werden
- Zuverlässige und solide Ergebnisse auch zu einem späteren Analysezeitpunkt
Die fehlende Fähigkeit der Lebendzellzahlbestimmung war der Grund weshalb die qPCR-Methode in der Vergangenheit suboptimal für den Einsatz in der Abwasseranalytik war und andere Techniken wie z.B. die Mikroskopie den Vorzug erhielten.
Die Testsysteme der DyeNA Genetics sind in der Lage die Lebendzellzahl mittels qPCR-Methode zu bestimmen.
Somit vereinen unsere Tests die Vorteile der qPCR Technologie wie Schnelligkeit, Genauigkeit und Präzsion mit dem Vorteil der Lebendzellzahlbestimmung aus der Mikroskopie zu neuen, innovativen Tests für die Abwasseranalytik.